【摘要】 探讨应用连续切片EnvisionTM法检测角蛋白表达对判断头颈鳞状细胞癌淋巴结微转移的效果及微转移对肿瘤预后的影响。方法 术中淋巴结标本行快速EnvisionTM法检测角蛋白CKAE1/AE3，与常规冰冻病理对淋巴结微转移检出率比较。对14例下咽癌、声门上型喉癌淋巴结标本连续病理切片，比较常规病理检测与EnvisionTM法对淋巴结微转移检出率。结果 快速EnvisionTM法可检出2粒常规冰冻病理不能检出的淋巴结微转移，连续切片应用EnvisionTM法可检出5粒常规病理阴性的淋巴结(5/216)存在微转移灶。结论 EnvisionTM法检测角蛋白CKAE1/AE3表达可快速判断头颈部鳞状细胞癌淋巴结微转移，存在多粒淋巴结微转移的患者预后可能较差。

　　【关键词】 头颈肿瘤 微转移 淋巴结 角蛋白 蛋白表达

　　ZHANG Jianli1, WANG Yuejian1, CHEN Weixiong1, HU Weiwei2, LI Guangmin2

　　(1. Department of Otolaryngeal & Head and Neck Surgery;

　　2. Department of Pathology, First People′s Hospital of Foshan, Foshan 528000, Guangdong, China)

　　To detect lymph node micrometastasis and explore the clinical significance of lymph node micrometastasis in head and neck squamous cell carcinoma. Methods 25 lymph nodes taken from head and neck squamous cell carcinoma and frozen in the operations, and 223 lymph nodes taken form 14 cases of hypopharynx cancer or supraglottis cancer and serial sectioned were stained with the EnvisionTM system with monoclonal antibody CK(AE1/AE3) and H&E staining. The results were compared. Results Two micrometastasis lymph nodes which were not found by routine frozen section histological staining were found by the quick EnvisionTM system, and five micrometastasis lymph nodes were detected from 216 H&E negative lymph nodes by using the immunohistochemisty EnvisionTM system. Conclusion The EnvisionTM system is effective and reliable and can be used for intraoperative micrometastasis examination. Patients with two or more micrometastasis lymph nodes may have a poor prognosis.

　　Key words: Head and neck neoplasm; Micrometastasis; Lymph nodes; Keratin; Protein expression 头颈部鳞状细胞癌颈部淋巴结转移是影响患者预后的重要因素之一，正确诊断淋巴结转移是头颈外科亟待研究的课题之一,1993年国际抗癌联盟(UICC)在《肿瘤TNM分期补充材料》中淋巴结微转移定义为远处转移灶增殖至1～2?mm。本研究旨在探讨快速免疫组?织化学检测在诊断头颈部鳞状细胞癌中的应用。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料 DAKO公司产EnvisionTM试剂盒、AE1/AE3(鼠抗人:单克隆抗体 M3515 1∶100)。

　　1.2 一般资料

　　1.2.1 术中冰冻切片组 随机选取1998年2月至2006年5月在我科住院CN0(临床检查未发现转移淋巴结)头颈部鳞状细胞癌患者20例，其中声门上型喉癌11例，下咽癌9例，根据淋巴引流第一站理论，术中选取25粒第Ⅱ、Ⅲ区淋巴结标本，每份冰冻标本连续切片3张,层厚4?μm，1张行常规冰冻H&E染色,另1张用EnvisionTM免疫组化法检测CKAE1/AE3，共取得H&E玻片25张，CKAE1/AE3染色玻片25张，1张留待术后常规病理检测。

　　1.2.2 术后切片组 随机选取1998年2月至2005年5月，在我科术前未行放化疗诊断为下咽鳞状细胞癌、声门上型喉鳞状细胞癌患者14例,其中CN0 7例，CN1为7例，N2以上不列入观察。治疗为手术切除原发灶并同期行患侧或双侧侧颈淋巴结清扫术(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。按照1991年美国耳鼻咽喉头颈外科基金学院及美国头颈外科学会制定淋巴结分区法(Ⅵ区法)，分别收集Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区淋巴结标本223粒(22侧)，参照Haagensen透明法获取淋巴结，标记编号，按区组送病理检测。为更充分了解淋巴结微转移情况，将淋巴结进行原切片(A组)并与连续切片(B组)进行比较， A组：取紧贴原切片面切片2张，按4?μm一层切片，每层连续切片2张，1张行常规H&E染色,另1张用EnvisionTM免疫组化法检测CKAE1/AE3;B组：每份标本切片3～5层，每层间隔1?mm，按4?μm一层切片，每层连续切片2张，1张行常规H&E染色,另1张用EnvisionTM免疫组化法检测CKAE1/AE3。

　　1.3 免疫组化染色及步骤 HE染色按照常规方法进行。

　　1.3.1 淋巴结标本EnvisionTM法 按照DAKO公司的EnvisionTM试剂盒操作规程操作，通过烤片、脱腊、酒精水化、柠檬酸缓冲液微波抗原修复、加一抗体、加二抗体、DAB显色，无水酒精脱水,中性树胶封片等步骤。整过程耗时约90?min。

　　1.3.2 冰冻标本EnvisionTM法 选取术中切除的新鲜淋巴结标本，标本经冷丙酮固定10?min，切片，加一抗体、加二抗体、DAB显色，无水酒精脱水,中性树胶封片等步骤。整过程耗时约30?min。

　　1.4 观察方法 淋巴结病理检查及结果判断由我院2名病理科指定高级职称医生协助，阅片前淋巴结部位及患者诊断均不告知。免疫组化阳性判断标准是：淋巴结存在转移者，角蛋白表达位于胞浆处，显微镜下观察示胞浆呈棕黄色，细胞核为蓝色(图1)。H&E染色淋巴结转移判断标准为：淋巴窦变形，破坏，淋巴结构异常，镜下见异型细胞，细胞核较淋巴细胞大。淋巴结微转移判断标准：淋巴结转移病灶小于等于2?mm, 癌细胞局限于淋巴结内, 淋巴结结构无明显破坏(图2)。

　　头颈部鳞状细胞癌淋巴结转移灶CKAE1/AE3表达(EnvisionTM法， ×10)头颈部鳞状细胞癌淋巴结微转移灶CKAE1/AE3表达(EnvisionTM法，×10)

　　2 结 果

　　2.1 术中冰冻切片组 术中冰冻病理术中发现7粒淋巴结转移，EnvisionTM法发现9粒淋巴结CKAE1/AE3阳性，提示淋巴结转移，术后病理证实9粒淋巴结均存在淋巴结转移,其中新检测的转移淋巴结为微转移。

　　2.2 术后切片组 14例下咽癌、声门上喉癌患者颈廓清术后标本223粒淋巴结行免疫组化检测，除7粒术后常规病理报告阳性淋巴结均表现阳性外，发现5粒淋巴结转移。其中A组2粒，B组H&E染色发现2粒淋巴结转移，而EnvisionTM法发现3粒存在角蛋白表达，再阅HE片证实存在淋巴结转移，5粒淋巴结均符合淋巴结微转移，见表1。

　　其中1～6例为声门上型喉癌患者，而7～14例为下咽癌患者。

　　3.1 淋巴结术中病理检测 淋巴结转移是影响头颈鳞状细胞癌患者预后的重要指标。淋巴结转移的患者预后要比不存在淋巴结转移的患者局部控制率及生存率要下降50.0%以上[1]。

　　淋巴结转移癌的确切诊断最终需要病理证实。病理诊断的方式包括有术中冰冻病理、常规HE染色、特殊染色、免疫组化检测、逆转录PCR技术、连续切片的HE染色等。应用更复杂的检查技术，将更准确的发现隐性转移，甚至是分子水平的癌灶。由于术中冰冻病理能在手术中提供给临床医生较准确的病理诊断支持，协助临床医生在术中更准确判断病灶范围，临床应用广泛且临床意义重大。但是常规冰冻病理也存在一定误差，冰冻切片较厚，细胞未经过脱水处理，短时间内要求病理医生下诊断，对病理医生要求较高。对于淋巴结微转移灶来说，由于淋巴结结构无明显破坏，转移灶仅为数个细胞时，造成术中冰冻病理假阴性。Finn等[2]回顾性分析了头颈部鳞癌CN0患者淋巴结清扫术中冰冻病理结果，发现灵敏度为56.0%，特异度为70.0%，提示在CN0患者淋巴结术中冰冻病理准确性不高，不能为临床医生提供较准确病理支持。Weiser等[3]通过对890例乳腺癌患者进行前哨淋巴结检测发现，术中冰冻病理对于大体淋巴结转移(macrometastatic disease)(灵敏度为91.0%)远比微转移(micrometastases)(灵敏度为17.0%)有效。

　　免疫组化拥有更高的灵敏度及准确度，已作为常规HE切片的有效补充手段。EnvisionTM法将第二抗体特异性抗体与辣根过氧化物酶通过多聚葡萄糖骨架联结成一个多聚体,由于多聚体结构的特异性，能连接更多的兔、鼠的免疫球蛋白，增强信号扩大系统，使第二抗体与第一抗体充分结合，具有更高的敏感性，且检测时间明显缩短，可以在30?min检测出检测标记，逐步应用于术中免疫组化病理检测。免疫组化EnvisionTM法在一般免疫组化室就能完成，容易推广。马大烈等[4]在文献中表明EnvisionTM法较SP、SAP法拥有更好的敏感性及特异性。Barrera等[5]通过对头颈部磷状细胞癌淋巴结标本进行常规病理及免疫组化病理检查，发现常规病理标本中发现微转移率N0为3.8%，N1为5.0%,免疫组化检测发现淋巴结为转移率N0为29.0%，N1为45.0%，提示通过免疫组化技术能提高淋巴结微转移诊断率。本研究中表明，免疫组化技术比常规HE染色有更高的准确率，主要两者区别在淋巴结的微小转移灶上。

　　上皮细胞胞浆中存在骨架蛋白, 主要包括肌动蛋白、微管蛋白、 角蛋白, 其中角蛋白为上皮细胞的特异标记物。正常淋巴组织中不存在鳞状上皮细胞;头颈肿瘤以鳞状细胞癌为主，鳞状细胞癌为上皮细胞，同样有上皮细胞的组织特性，而且角蛋白是上皮细胞的特异标记物，如淋巴结转移则淋巴结内存在鳞状细胞癌转移灶，则淋巴结中角蛋白可以表达及显示，从而判断是否存在转移。角蛋白(CK)作为判断上皮细胞及肿瘤转移已在大量文献中得到验证，我们选用角蛋白为广谱细胞角蛋白CK(AE1/AE3，CK(AE1/AE3)主要标记角化上皮、复层鳞状上皮、复层上皮、增生的角化上皮和单层上皮。在本研究中，存在淋巴结转移灶在免疫组化检测中角蛋白均在细胞浆中表达，甚至一些微转移灶，证明应用角蛋白免疫组化检测能提高淋巴结的检出率，特别是淋巴结微转移。

　　在术中病理检测中，术中应用EnvisionTM法检测淋巴结耗时约30?min，基本与常规冰冻病理同时出检查结果，而且角蛋白表达良好，染片满意。常规冰冻病理发现7粒淋巴结转移，术中应用EnvisionTM法检测出9粒淋巴结中CK AE1/AE3阳性，常规冰冻病理阳性均存在CK AE1/AE3表达，术后病理证实9粒淋巴结均存在淋巴结转移。查阅2粒常规冰冻病理假阴性的淋巴结标本切片发现，转移灶为数十个异型细胞，淋巴结结构及淋巴窦基本完整，包膜无破坏，2粒淋巴结均符合淋巴结微转移。由于角蛋白在细胞浆中表达并染色中显示为黄色，在众多兰染的淋巴细胞中很突出，能较容易发现转移灶。根据免疫组化提示转移灶的位置，在术中病理切片中也能找出转移灶。

　　3.2 淋巴结微转移 淋巴结的转移方式现认为是当肿瘤细胞脱离原发灶时，侵袭和穿透基底膜，与毛细淋巴管内皮细胞粘连，穿过内皮细胞间的裂隙进入淋巴管，随淋巴一流转运，通过输入淋巴管进入第一站淋巴结的边缘窦，在此停留增殖，进一步穿过淋巴窦的内皮细胞和基底膜进入淋巴结实质内生长，破坏正常淋巴组织，再经输出淋巴管进入下一站淋巴结，最后进入全身血液循环系统[6]。

　　淋巴结微转移属淋巴转移的较早阶段，其临床意义上仍有争议。大部分学者认为淋巴结微转移的预后较未存在淋巴结转移差。毕竟病理提示存在淋巴结微转移，术后病理由原来的PN0至PN+,可能由原来的Ⅰ期变为Ⅱ期或更高，提示预后不良。Harttveit等[7]通过对1?069例乳腺癌患者的淋巴结研究，发现淋巴结微转移转移灶的部位与预后有密切关系，当转移灶位于淋巴管或淋巴结窦下窦时，预后与阳性淋巴结相同，而转移灶位于淋巴组织中，预后与阴性淋巴结相同。杨宏宇等[8]对46例口腔鳞癌的淋巴结检测出5例存在淋巴结微转移，4例复发，提示淋巴结微转移对预后仍有影响。

　　我们为了更加充分了解淋巴结情况，特别是淋巴结微转移情况，采用淋巴结半连续切片的方法，由于微转移的定义是淋巴结内转移灶在1～2?mm，因此淋巴结按1?mm一层切片，每层切片连续切3张，1张HE染色，1张行EnvisionTM法检测。随访观察存在淋巴结微转移患者术后情况，以探讨淋巴结微转移的临床意义。本实验中对14例声门上型喉癌及下咽癌的患者，术后病理诊断为N0或N1，平均随访时间为23个月，选取上述病例同期行颈廓清术的淋巴结标本223粒，常规HE染色提示7粒淋巴结转移，用Envision免疫组织化学检测及半连续切片，结果又发现5粒存在转移的淋巴结，其中新发现5粒淋巴结符合淋巴结微转移。由于转移灶仅为数个癌细胞，淋巴结结构无明显破坏时，依靠细胞形态等判断淋巴结转移有一定的难度。而角蛋白AE1/AE3抗体对上皮组织及细胞有特异染色，使淋巴结构及淋巴细胞均不着色，仅使转移癌细胞浆及包膜着色，并在大量淋巴细胞背景中显现出来，能有效克服单一依靠细胞形态来判断淋巴结转移。在常规病理切片中显示转移灶仅为数个转移细胞组成，而淋巴结构无明显破坏，可能造成病理医生在阅片过程中忽略，造成术后的假阴性结果。A组发现2粒淋巴结存在转移灶，2粒淋巴结均为微转移灶，提示免疫组化检测可发现更小的淋巴结转移灶，Tu等[9]报道颈淋巴结清扫术后病理切片阴性的患者有10%术后复发，术后淋巴结病理阴性的切片通过免疫组化检查发现8%～20%的淋巴结存在转移，存在转移的淋巴结病灶直径为1.36?mm。由于临床工作中不可能应用连续切片来诊断淋巴结转移，而仅通过数张切片来判断，不能代表整个淋巴结的状况，特别在转移灶小的情况。B组较A组多检测出3粒淋巴结转移可以证明上述情况。在B组中，半连续切片及免疫组化组化检测均比常规切片多检测出转移淋巴结，提示通过多层切片可以提高淋巴结转移的检测率，Van等[10]对头颈鳞癌36侧颈廓清标本进行连续切片检查，发现25%患者存在颈部淋巴结转移，而且多数为无法发现的微转移。而免疫组化组化比半连续切片多发现1粒淋巴结，免疫组化组多发现淋巴结转移灶经再阅片发现转移灶仅为数个转移癌细胞，在阅片过程中可能遗漏造成假阳性。由于免疫组化检测不能替代H&E染色，作为免疫组化检测的一个重要原则是作免疫组化诊断时，结合HE形态十分重要，选择抗体及判断结果都要以HE形态为依据，因此，免疫组化检测仅能提供可疑转移灶，最终确诊仍要依靠HE形态。我们通过角蛋白在众多兰染的淋巴细胞中表达，来提示转移灶部位，协助病理医生在阅HE片中发现可能存在的微转移灶。新发现存在微转移的淋巴结属于Ⅱ、Ⅲ区，淋巴结结构及包膜完整，未发现存在包膜外侵犯情况。由于发现新的淋巴结转移，提示淋巴结转移范围较原来增加，淋巴结转移粒数增加，增加远处转移及其他区淋巴结转移的可能。如表1所示，术后随访发现1例下咽癌患者6月后患侧V区淋巴结复发，1例喉癌患者12月后患侧淋巴结V区证实复发，常规术后病理提示1粒淋巴结转移，免疫组化证实存在2粒淋巴结转移，其中新发现1粒淋巴结证实为微转移。上述2粒均行侧颈淋巴结清扫术，而复发淋巴结位于V区，提示存在多粒淋巴结微转移时，淋巴结远处转移可能增加，术后需要放疗可能增加。Lim等[11]指出，N2b以上头颈鳞癌与V区淋巴结转移可能性呈正相关，对于N2b以上患者需行改良或根治性颈淋巴结清扫术。淋巴结微转移较多时可能提示患者预后较差。对于2例患者仅存在1粒淋巴结微转移，随访结果与PN0及PN1相近，由于病例数少，无法提示1粒淋巴结微转移灶对预后的影响，还需要进一步探讨及研究。

　　术中应用EnvisionTM法检测淋巴结能发现常规冰冻病理切片无法发现淋巴结微转移灶，是一种术中辅助快速病理检测淋巴结微转移的有效方法。淋巴结微转移，与预后有关，需密切随诊或积极治疗。

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